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1831년 영국 해군은 비글호 항해 때 로버트 피츠로이 함장과 동행할 박물학자를 구하고 있었다. 항해 목적은 파타고니아, 푸에고 섬, 칠레, 페루 등 남아메리카의 해안과 태평양의 섬들을 조사하여 일련의 크로노미터(chronometer : 바다에서 특히 경도[經度]를 측정할 때 이용되는 매우 정확한 시간측정장치) 측점(測點)을 수립하려는 것이었다. 이때 헨슬로 교수가 다윈을 추천했는데 본인은 원했지만 그의 아버지가 반대하면서 "만약 누군가 상식 있는 사람이 너에게 가라고 권유한다면 승낙할 것이다"라고 말했다.

이 상식 있는 사람의 구실을 한 사람이 바로 다윈의 외삼촌인 조시아 웨주우드 2세였고, 그의 설득으로 다윈은 1831년 12월 27일 비글호를 타고 데이번포트를 떠나 5년간 항해할 수 있었다.

케이프베르데 제도에서 처음으로 화산에 관한 실물교육을 받았는데, 그는 화산에 관한 찰스 라이엘의 저서 〈지질학 원리 Principles of Geology〉의 유효성을 스스로 시험할 수 있었다. 이 책은 헨슬로 교수가 다윈에게 가져가라고 권하면서도 믿지는 말라고 했던 것이었는데, 다윈은 자신의 현지 관찰을 통해 라이엘의 동일과정설의 원리를 확실하게 받아들이게 되었으며 장차 과학자가 될 기초를 다졌다. 브라질에서는 처음으로 열대림을 보았고, 아르헨티나에서는 처음으로 나무늘보·마스토돈·말 등의 화석을 발견했다.

푸에고 섬에서는 사람이라고 보기 어려울 정도로 미개한 인종도 보았다.

칠레에서는 지진을 목격하고 육지의 융기에 대한 지진의 영향, 화산 폭발과 지진과의 관계 등을 관찰했다. 항해중 상륙하면, 말을 타고서 길고 위험한 탐험을 나가 채집하며 사냥하는 것을 되풀이했는데, 후에 이러한 탐험에 열중했던 것이 헛된 일이 아니었음을 보여주었다. 그는 어디에서나 산을 보면 등산했으며, 칠레에서 안데스 고원을 넘어 아르헨티나로 가는 여행 도중에는 벌레들에게 많이 물리기도 했다.

비글호는 갈라파고스 제도로부터 타히티, 뉴질랜드, 오스트레일리아, 코코스 제도, 모리셔스 제도, 남아프리카, 세인트헬레나 섬 등을 항해한 다음 크로노미터를 점검하기 위해 다시 브라질에 갔다가 귀국했다. 1836년 10월 2일 플리머스 항에 상륙하여 10월 5일에 고향인 슈루즈베리에 돌아왔다. 비글호 항해 중에 예리한 통찰력으로 자연을 관찰하면서 얻은 식견, 사고, 채집품 등은 그의 진화설과 자연선택설의 수립은 물론 기타 연구 업적의 모태가 되었다. 그는 특히 자연선택에 관한 견해들 중 상당 부분은 갈라파고스 제도에서 관찰한 동물들의 생태에서 얻은 영감을 바탕으로 형성되었다고 밝혔다.