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그의 유언에 따라 거액의 기부금으로 존스홉킨스대학교와 존스홉킨스 병원이 설립되었다. 존스 홉킨스는 담배농장을 경영했던 퀘이커교도의 집안에서 태어났는데, 부모가 종교적인 양심으로 노예들을 해방시켰기 때문에 12세 때에는 학교를 그만두고 가족과 함께 들에 나가 일을 해야 했다.

자신이 공부를 중단했던 일과 흑인들을 자유롭게 해야 한다는 사명감은 일생 동안 그에게 영향을 미쳤다. 17세 되던 해 그는 삼촌에게서 식료품점 경영에 관한 여러가지 일을 배우기 위해 볼티모어로 갔다. 사업경영을 잘 해나갔지만, 1819년 삼촌이 농민들이 위스키로 물품값을 지불하는 데 반대하자 삼촌과의 불화로 독립하게 되었다. 그후 1명의 동업자와 사업을 하다가 나중에는 3명의 형제들과 사업계에 뛰어들었다.

홉킨스 형제들은 메릴랜드·버지니아·노스캐롤라이나 주, 심지어 오하이오 주까지 마차로 물품수송을 하여 크게 성공했다. 그들은 수송의 대가로 기꺼이 위스키를 받았고, 그것을 '홉킨스 베스트'(Hopkins' Best)라는 상품명으로 팔았다. 홉킨스는 결혼을 하지 않았고 여행도 하지 않았으며 개인적인 오락을 위해서는 거의 돈을 소비하지 않고 오직 사업에만 전력을 기울였다.

1847년 은퇴 당시 홉킨스는 엄청난 부를 축적하게 되었다. 볼티모어의 부동산과 사업에 효과적으로 투자하여 재산을 늘려나갔고 볼티모어와 오하이오철도회사의 주식을 개인으로는 가장 많이 보유하게 되었다. 또한 몇몇 은행의 이사를 지냈고 보험회사·도매상점·증기선회사에 투자를 하는 등 볼티모어의 상업발전에 중요한 역할을 했다. 이러한 성공을 바탕으로 해서 그는 대학과 병원을 만들기 위해 2개의 법인을 설립했다. 그의 유언(1870)에 따라 700만 달러가 이 두 기관에 분배되었다. 흑인 어린이를 위해 고아원도 기증했다. 그의 유언에 따라 존스홉킨스대학교는 1876년, 병원은 1889년에 설립되었고, 의과대학은 양쪽 시설을 모두 활용하면서 1893년에 처음 학생들을 받아들였다. 이때 여학생도 남학생과 동일한 조건으로 입학이 허용되었다.