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19세기 미국에서 가장 유명한 배우가문 출신이다. 배우 주니어스 브루터스 부스의 10남매 중 9번째로 태어난 그는 일찍부터 연극배우로서 뛰어난 자질을 보여주었다. 그러나 동시에 정서불안과 심한 이기주의적 성격을 지니고 있어 당대의 인기있는 일류배우로 인정받고 있던 형 에드윈을 매우 시기했다.

1856년 볼티모어 연극계에 데뷰했지만 성공을 거두지 못하여 1859년까지 필라델피아에서 단역배우로 활동하다가 그해 버지니아 주 리치먼드의 셰익스피어 극단에 들어갔다. 1860년 미국 최남부 순회공연에서 폭넓은 인기를 얻어 남북전쟁 동안 계속 출연요청을 받았으며 남부의 대의를 열광적으로 지지하여 공공연하게 노예제를 옹호하고 링컨을 비난하고 다녔다. 그는 1859년에 노예제폐지론자 존 브라운을 교수형에 처했던 리치먼드 민병대에 자원했고 전쟁중에는 남부의 비밀첩보원으로 일했다.

1864년 가을경부터 부스는 세상을 놀라게 할 링컨 대통령 납치계획을 세우기 시작했다. 먼저 여러 명의 공모자들을 모은 다음 1864~65년 겨울 내내 이들과 워싱턴 D. C.에서 자주 모임을 가지면서 여러 가지 납치계획을 세웠다. 그러나 몇번의 시도가 실패하자 결국 대통령과 그의 관료들을 죽이기로 결심했다. 1865년 4월 14일 아침에 그는 대통령이 워싱턴에 있는 포드 극장에서 희극 〈우리 미국인 사촌 Our American cousin〉의 저녁 공연을 관람할 것이라는 정보를 알아냈다. 그래서 서둘러 일당을 모은 다음 각자에게 임무를 맡겼는데 여기에는 국무장관 윌리엄 수어드 암살도 포함되어 있었다.

부스 자신은 링컨을 암살하기로 했다. 저녁 6시경 아무도 없는 극장에 들어간 그는 칸으로 막혀 있는 대통령 관람석 바깥문을 안에서 잠가 열리지 않게 해놓았다. 연극의 3막이 진행되는 동안 다시 들어온 그는 링컨 일행을 경호하는 사람이 없음을 확인했다. 그는 관람석으로 들어가면서 권총을 뽑아 링컨의 머리 뒤쪽을 향해 쏘았다. 난간에 매달려 한 관객과 잠시 맞붙어 싸우다가 "영원한 폭군이여! 남부는 복수했다"고 외치면서 뛰어내렸다. 무대 위로 떨어지면서 왼쪽 다리뼈가 부러졌지만 용케도 골목으로 빠져나와 말을 타고 도망가는 데 성공했다. 국무장관은 암살을 면했지만 링컨은 다음날 아침 7시 조금 넘어 죽었다.

12일 뒤 연방군이 라파하노크 강 바로 남쪽에 있는 버지니아의 한 농장 담배창고에 부스라는 사람이 숨어 있다는 정보를 입수하고 그곳으로 출동했다. 창고에 불을 지른 뒤 그 남자의 시체를 발견했는데 자살을 했는지 병사의 총에 맞아 죽었는지는 분명치 않다. 시체는 워싱턴으로 운반되었으며 친지들이 신원을 확인했다. 그러나 시체가 너무 심하게 훼손되어 신원을 분명히 밝히지 못했기 때문에 부스인지 의심하는 사람도 있었다. 부스가 아닌 다른 사람이나 조직이 암살계획을 꾸몄을 것이라는 소문도 분분했지만 사실로 확인된 것은 없다.