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염기서열결정 및 전자현미경분석 등 여러 분석방법을 수행하여 유전자의 구조 및 기능을 밝히게 하는 기법이다.

기본적으로 유전자 클로닝에는 원하는 DNA 절편을 삽입시킬 수 있는 '클로닝 벡터'(cloning vector：세균 내에서 주염색체와는 독립적으로 복제할 수 있는 환상 또는 선상의 DNA로, 주로 플라스미드와 λ파지[λ-phage]가 많이 사용됨)와 숙주세포가 필요하며 그 기본절차는 크게 2단계에 걸쳐 진행된다. 첫단계는 재조합 DNA제조과정으로 관심대상인 적당한 크기의 DNA 절편을 클로닝 벡터의 특정부위에 삽입하여 재조합된 DNA를 만드는 과정이다. 보통 클로닝 벡터에는 외부의 DNA를 용이하게 삽입할 수 있는 특정부위인 '폴리클로닝좌'(polycloning site)가 있으며, 이 부위를 여러 가지 제한효소에 의해 절단할 수 있도록 설계되어 있다.

따라서 일단 폴리클로닝좌에서 삽입부위가 결정되면, 클로닝하고자 하는 DNA 절편과 벡터는 그 삽입부위의 제한효소로 각각 절단하고 2종의 DNA를 연결시키게 된다. 이때의 반응에는 DNA 리가아제를 사용하게 되며 결국 2종의 DNA 분자가 하나의 DNA 분자를 형성하게 되는데, 이때의 DNA 분자를 재조합 DNA라 한다. 2번째 단계는 유전자 클로닝 과정으로 위의 재조합 DNA를 숙주세포의 내부로 주입하고(형질전환), 이 형질전환된 세포를 배양함으로써 세포 내의 재조합 DNA를 대량으로 증폭시키는 과정이다. 이렇게 얻은 형질전환된 동일한 세포군을 클론(clone)이라 한다. 위와 같이 엄밀하게 살펴보면 유전자 클로닝은 재조합 DNA 제조와 유전자 클로닝의 두 독립된 단계로 진행되지만, 일반적으로 두 과정을 하나의 과정으로 묶어 간단히 DNA 재조합기술 또는 유전자 클로닝이라 한다.

한편 위의 특정 DNA 절편을 단순히 클로닝에 의해 증폭된 재조합 DNA를 확보하고 이를 이용해 유전자의 구조를 결정하기도 하지만, 숙주세포 내에서 재조합 DNA에 삽입된 특정 DNA 절편의 유전정보를 발현시켜 최종생산물인 단백질을 생산하게 할 수도 있다. 결국 그 단백질의 구조 및 기능을 조사함으로써 특정 유전자의 기능을 분석할 수도 있는 것이다. 이러한 목적으로 개발된 클로닝 벡터를 특히 '발현 벡터'(expression vector)라고 한다.

그러므로 발현 벡터를 이용한 유전자 클로닝은 유전공학의 핵심기법이라 할 수 있다.