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기존의 크로마토그래피(겔여과, 이온교환, 면역친화성크로마토그래피)와 비교했을 때 몇 가지의 장점을 지니고 있어 현재 많은 실험실에서 무기이온·단백질·펩타이드·아미노산·지질·탄수화물 등의 여러가지 무기·유기화합물을 분리·정제하는 데 사용하고 있다. 이 방법의 장점은 첫째로 분석률이 높아 기존의 크로마토그래피로 분석이 어려운 혼합물들을 분석할 수 있다는 것이다. 둘째로 분석시간이 기존의 방법보다 훨씬 짧다는 것이다.

극히 입자가 고운 유리 또는 수지 알갱이로 채워진 좁고 긴 관(column) 속에 혼합물을 넣고 고압을 가하므로 대부분의 경우 1시간 이내에 분석이 이루어진다. 셋째로 피코몰(picomole：10-12㏖) 정도의 아주 작은 양의 화합물을 분리·정제하여 수량화할 수 있으며, 넷째로는 분석과정의 자동화가 가능하다는 것이다. 단점은 상업적으로 구입해서 사용되는 관의 용량이 매우 작아서 한 번에 많은 양의 화합물을 정제하지 못하는 것이다.

그러나 실제로 고성능액체크로마토그래피는 하나 이상의 기존 크로마토그래피를 사용하여 단백질 등을 분리한 후 미량의 상태에서 사용하기 때문에 작은 용량은 거의 문제가 되지 않는다.

고성능액체크로마토그래피에는 역상 HPLC(reverse phase HPLC, Rp-HPLC)·이온교환 HPLC(ion-exchange HPLC)·분자 HPLC(molecular size HPLC)·소수성 HPLC(hydrophobic interaction HPLC) 등이 있다. 역상 HPLC는 화합물의 소수성 차이를 이용한 방법으로 30~40개 이하의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 등의 분리·정제에 가장 널리 사용되는데, 일반적으로 높은 회수율을 보이지만 정제시 단백질을 변성시켜 생물학적 활성을 파괴하는 문제가 있다.

최근에 개발된 소수성 HPLC 역시 화합물의 소수성 차이를 이용한 방법인데 역상 HPLC와 달리 단백질 등을 변성시키지 않고 분리시킬 수 있다. 이온교환 HPLC는 분자가 갖고 있는 전하의 차이를 이용하여 화합물을 분리하며, 분자 HPLC는 분자의 크기에 근거하여 큰 화합물에서 작은 화합물의 순서로 분리한다.